Динамика синтеза белков в мононуклеарах крови больных ревматоидным артритом при биорезонансной терапии

Б.И. Исламов, А.А. Карпеев, Е.Е. Мейзеров, М.Ю. Готовский

(Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино, Федеральный научный клинико-экспериментальный центр традиционных методов диагностики и лечения МЗ СР РФ, г. Москва)

 

Ревматоидный артрит (РА) – наиболее распространенное заболевание среди хронических воспалительных болезней суставов, распространенность его в различных странах примерно одинакова. По данным В.А. Насоновой с соавторами [1], РА болеют от 1 до 2 % населения мира, что ярко демонстрирует актуальность поиска эффективных методов его терапии.

Исследования, проведенные нами ранее, показали нарушения синтеза белков в лимфоцитах крови больных ревматоидными артритами [2], что приводит к функциональной недостаточности иммунокомпетентных клеток, которая развивается вследствие внешних и внутренних неблагополучных обстоятельств. Следовательно, ни антибиотики, ни нестероидные противовоспалительные препараты, ни гормоны, ни иммунодепрессанты не могут решить проблемы, поэтому мы попытались восстановить нарушения синтеза белков в лимфоцитах крови больных альтернативными методами воздействия.

 

Материалы и методы исследования

В исследовании приняли участие 40 человек (большинство женщины), из них с ревматоидным артритом – 30 (13 – в возрасте (В) 32 (4 года, продолжительностью заболевания (П) 2-5 лет, степенью активности (A) I-II, на стадии ревматоидного процесса (С) I-II, функциональной недостаточностью (ФН) I-II; 17 – В = 45 (12 лет, II = 5–15 лет, А = II-III, С = II-III, ФН = II). Контрольную группу составили практически здоровые люди (10 человек) той же возрастной группы.

Большинство пациентов с ревматоидным артритом были серопозитивными, имели системные проявления РА в виде полиней-ропатии, лимфаденопатии, кожных ревматических узелков и др. До обращения к нам все пациенты проходили курс лекарственной терапии (кортикостероиды, базисные препараты и др.) в стационарах.

Курс лечения проводили комплексно. Применяли индвидуально подобранные гомеопатические препараты, сеансы экзогенной и эндогенной биорезонансной терапии (БРТ) – всего 10-15 сеансов по 1–2 сеанса в неделю продолжительностью до 30 мин. (Биорезонансная терапия: Методические рекомендации МЗ РФ № 2000/74. – М.: НПЦ ТМГ МЗ РФ, 2000. – 26 с.). Контроль эффективности лечения осуществляли по показателям электропроводности биологически активных точек по методу Р. Фолля и известными объективными (биохимические анализы крови и антропометрические данные) и субъективными (жалобы) методами оценки.

Препараты лимфоцитов получали из 10 мл гепаринизированной периферической крови центрифугированием в градиенте фиколл-верографин (1,077 г/см³) при 400 g в течение 40 мин. Суспензии клеток дважды отмывали фосфатным буфером Дюльбекко (ФБД, Sigma) и один раз средой для культивирования RPMI 1640 (Sigma) центрифугированием при 400 g в течение 20 мин. Далее лимфоциты инкубировали при 37°С в течение 3 часов в среде для культивирования RPMI 1640, содержащей ³⁵S-метионин с активностью 10 мкКи/мл, в режиме легкого встряхивания («состояние покоя»). Концентрация клеток в среде составляла 2 х 10⁶ кл/мл. После инкубации клетки осаждали и использовали для экстракции белков.

Тепловой шок лимфоцитов проводили при 44°С в течение 15 мин. в среде RPMI 1640, содержащей ³⁵S-метионин (10 мкКи/мл), и далее инкубировали клетки в этой же среде при 37°С в течение 3 часов при условиях, указанных выше.

На всех этапах выделения и инкубации лимфоцитов гибель клеток, которую отслеживали окрашиванием клеток 0,2 % раствором трипанового синего и подсчетом живых и мертвых клеток в камере Горяева, не превышала 3 %.

Полипептидный состав белков, синтезированных de novo в лимфоцитах, анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСП) по Лэммли [3] и авторадиографии для количественного анализа и с помощью двумерного электрофореза в модификации Целиса с соавт. [4] и авторадиографии для визуальных оценок.

В качестве маркеров молекулярной массы использовали стандартные наборы белков – маркеров для ДСП-электрофореза фирмы «Sigma». Изоэлектрические точки (рI) белков на двумерных электрофореграммах определяли по рI известных белков [4].

Авторадиографию проводили экспонированием гелей, предварительно окрашенных раствором 0,25 % кумасси R-250: 50 % этанол: 7 % уксусная кислота и высушенных на специальном приборе «Гель-1» (Украина), с рентгеновской пленкой РТ-1В (Свема) в течение 15 суток. Рентгеновские пленки проявляли в соответствии с их инструкциями, высушивали и сканировали на автоматическом двухлучевом денситометре (ИБФ, Пущино). Денситограммы анализировались с помощью интегратора Chromatopac C-R3A (Shimadzu).

Статистический анализ проводили с помощью критерия Фишера. В качестве сравниваемых величин было взято отношение количества вновь синтезированного белка, меченного ³⁵S-метионином, (площадь пика, соответствующего исследуемому белку на денситограмме с радиоавтографа) к общему содержанию белков в образце (суммарная площадь пиков всех белков на денситограмме, полученной при сканировании того же белкового образца, окрашенного кумасси R250). Достоверными принимались отличия при Р < 0,05.

Клинические и биохимические анализы крови проводились в соответствующих лабораториях лечебных учреждений.

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для попарно связанных выборок. Статистически достоверными принимались значения при Р < 0,05.

 

Результаты исследований и их обсуждения

Тепловой шок (ТШ) применяли как классический индуктор стресс белков или белков теплового шока (БТШ) [5, 6]. При этом гибель клеток не превышал 3 % величины, характерной для неспецифической гибели клеток при их выделении из крови. В ответ на ТШ в лимфоцитах условно здоровых лиц наблюдается увеличение синтеза белков с молекулярной массой 120, 95, 70 и 65 кДа, которые с помощью двумерного электрофореза были идентифицированы как БТШ соответствующих молекулярным массам семейств (для 70 кДа БТШ 72 и 73 кДа). Синтез других белков (конститутивных) при этом снижается на 30 % относительно синтеза при физиологической температуре (рис. 1).

Рис. 1. Синтез белков de novo в лимфоцитах крови здоровых людей (n = 10).

Обозначения: * – Р < 0,05, ** – р < 0,001

 

У больных РА способность лимфоцитов синтезировать БТШ и другие клеточные белки носит выраженный угнетенный характер и зависит от тяжести и продолжительности заболевания (рис. 2). При I степени активности ревматоидного процесса исходно наблюдается сниженный уровень конститутивного белкового синтеза лимфоцитами, который в ответ на ТШ незначительно ингибируется и индуцируются БТШ 95,70 и 65 кД (рис. 4 А, Б). Для II степени активности РА характерны заметно сниженный синтез белков при физиологической температуре, слабая индукция БТШ 70 и 65 кД и угнетение синтеза конститутивных белков в ответ на ТШ (рис. 2 В). В случае тяжелых форм проявления PA (II-III степень активности) синтез белков носит выраженный угнетенный характер как в покоящихся, так и в шокированных нагреванием лимфоцитах, при этом индукции синтеза БТШ не наблюдается (рис. 2 Г).

Статистический анализ денситограмм спектра синтезируемых de novo белков в лимфоцитах больных РА показал, что уровень белкового синтеза в лимфоцитах этих больных в исходном состоянии подавлен приблизительно на 60 % относительно контрольной группы (рис. 4), угнетенный характер синтеза распространяется на весь исследованный спектр белков (от 170 до 27 кД) и является статистически достоверным. ТШ еще более угнетает синтез конститутивных белков и достоверно индуцирует БТШ 95, 70 и 65 кДа, индукция синтеза БТШ 120 кД едва заметна (рис. 3). Однако уровень экспрессии их синтеза значительно уступает таковому в контрольной группе (рис. 5).

Способность лимфоцитов синтезировать белки in vitro в ответ на тепловой шок также зависит от тяжести и продолжительности заболевания. В случае средней тяжести РА (II степень активности) синтез конститутивных белков еще более подавляется, и индуцируются БТШ 72 и 73 кДа, редко 65 кДа. В более легких случаях (I степень активности) на фоне индукции перечисленных выше БТШ наблюдается лишь некоторое угнетение синтеза конститутивных белков. Встречаются тяжелые случаи (активность РА III степени), когда в ответ на ТШ синтез клеточных белков в лимфоцитах больных полностью подавляется.

После проведения терапии уровень синтеза белков в покоящихся лимфоцитах при РА практически достигает уровня в контрольной группе (рис. 6). Достоверно сниженным остается лишь синтез белков с молекулярной массой 170 и 111 кДа. В ответ на ТШ в РА лимфоцитах наблюдается увеличение синтеза стресс белков с молекулярной массой 120, 95, 70 и 65 кДа (рис. 7), причем синтез БТШ имеет более высокий уровень относительно условно здоровых лиц (достоверно для 70 и 33 кДа). Также более стабилен синтез конститутивных белков.

Рис. 2. Радиоавтограф и денситограммы авторадиографического исследования полипептидного состава белков, синтезируемых de novo в лимфоцитах крови больных РА I (а, б), II (в) и III (г) степени активности до (1 – до и 2 – после ТШ) и после (3 – до и 4 – после ТШ) терапии

 

Рис. 3. Синтез белков de novo в лимфоцитах крови у больных РА (n = 12) до курса БРТ.

Обозначения: * – Р < 0,05, ** – Р < 0,001

 

Сравнительный анализ показал, что с момента обращения больных в результате проводимой терапии в лимфоцитах наблюдается повышение уровня белкового синтеза приблизительно в 2 раза. В ответ на ТШ наблюдается аналогичная тенденция: уровень синтеза белков после курса терапии вырастает в 3 раза относительно такового до курса лечения, достоверное увеличение уровня синтеза обнаруживается для белков 170, 120, 95, 80, 70, 65, 60, 54, 43, 38, 36, 33, 30 и 27 кДа.

Рис. 4. Синтез белков de novo в лимфоцитах крови в состоянии покоя у больных РА (n = 12) до курса БРТ относительно здоровых людей (n = 10).

Обозначения: * – р < 0,05, ** – Р < 0,001

 

 

 

Рис. 5. Синтез белков de novo в лимфоцитах крови в ответ на тепловой шок у больных РА (n = 12) до курса БРТ относительно здоровых людей (n = 10).

Обозначения: Р < 0,05

 

 

 

Рис. 6. Синтез белков в лимфоцитах крови в состоянии покоя у больных РА (n = 12) после курса БРТ относительно здоровых людей (n = 10).

Обозначения: * – Р < 0,05, ** – р < 0,001

 

 

 

Рис. 7. Синтез белков в лимфоцитах крови в ответ на тепловой шок у больных РА (n = 12) после курса БРТ относительно здоровых людей (n = 10).

Обозначения: * – Р < 0,05, ** – Р < 0,001

 

 

Неподтвержденность инфекционного происхождения РА, характер изменений гуморального и клеточного иммунитета у больных данным заболеванием, системность его проявлений РА дают право рассматривать ревматоидный артрит как болезнь с аутоиммунным генезом. Однако неудовлетворительные поиски специфического аутоантигена, инициирующего и поддерживающего аутоиммунные процессы у пациентов с РА, не позволяют назвать ревматоидный артрит и чисто аутоиммунным заболеванием. В процессе развития ревматоидного воспаления имеет место поломка физиологических механизмов, затрагивающая состояние всех уровней функциональной организации иммунной системы. В настоящее время общепризнано, что в основе РА лежит формирование устойчивого патологического состояния, которое, нередко при условии генетической предрасположенности больного, формируется под влиянием неблагоприятных факторов внешней и внутренней среды: вторичные инфекции, травмы, психогенные факторы, лекарства и др. Такая мультифакторность РА разрешает рассматривать его как болезнь дезадаптации с первичным нарушением центральных механизмов регуляции гомеостаза организма [7]. И в этом ключе уже в новом (а на самом деле «старом») свете возникает роль БТШ. Современная ревматология придает способности лимфоцитов синтезировать БТШ значение одного из вероятных условий их нормальной иммунной активации. Тем не менее, БТШ синтезируются конститутивно и в ответ на стрессирующее воздействие самой разной природы во всех клетках и тканях организма и обладают более общей, чем в качестве шаперонов, физиологической функцией. Индуцируясь в ответ на тепловое воздействие, на тяжелые металлы, яды, реактивные формы кислорода и т. д., БТШ стабилизируют ДНК-белковый синтезирующий аппарат и цитоскелет клеток, тем самым обеспечивая клетки, ткани и органы механизмами адекватного реагирования на неблагоприятные изменения в окружающей среде [8]. И нарушение способности организма индуцировать стресс белки в условиях эмоционального стресса, инфицирования крайней физической нагрузке не может не отражаться на функциональной активности клеток, органов и систем организма, в том числе иммунной системы и конкретно лимфоцитов. Поэтому важной задачей современной медицины является регуляция одной из основополагающих функций жизнеобеспечения и целостности организма в целом, – способности клеток организма синтезировать стресс белки.

Восстановление синтеза БТШ, наблюдаемое в лимфоцитах крови больных РА в результате лечения, обеспечивает лечебную эффективность БРТ, что подтверждается также результатами биохимических анализов крови (рис. 8).

 

Рис. 8. Динамика некоторых биохимических параметров крови до и после курса БРТ

 

 

Таким образом, проведенные исследования позволяют определить важную роль в развитии гипореактивности лимфоцитов при РА угнетении в них синтеза как конститутивных, так и стресс белков. Проводимое нами лечение является принципиально новым, оно практически полностью восстанавливает регуляторные механизмы неспецифической защитной системы организма. Однако практически все больные до обращения к нам принимали иммунодепрессанты, гормональные препараты, нестероидные противовоспалительные препараты, поэтому мы не можем однозначно исключить роль этих лекарств, в развитии гипореактивности лимфоцитов. Ясно одно, – проводимое нами лечение восстанавливает синтез как конститутивных, так и стресс белков в лимфоцитах крови.

 

Литература

1. Насонова В.А., Фоломеева О.М. // Тер. арх. – 2000. – № 5. – С.5–8.

2. Фунтиков В.А., Исламов Б.И., Готовский Ю.В., Бобровскрш Р.В., Чайлахян Л.М. //Доклады академии наук. – 1999. – Том 364, № 1. – С.126.

3. Laemmly U.K. // Nature. – 1970. – Vol. 227. – P.680–685.

4. Cells J.E. et al.// Electrophoresis. – 1990. – N12. – P.956–959.

5. Lindquist S // Ann. Rev. Biochem. – 1986. – Vol. 55. – P.1151.

6. Welch W.J., Mizzen L.A., Arrigo A.P. // UCLA Symposia Mol. Cell. Biol. – 1989. – Vol.96. – P.187.

7. Насонова В.А., Астапенко М.Т. Клиническая ревматология. – М., 1989.

8. Меерсон Ф.З., Малышев И.Ю. Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца. – М.: Наука, 1993. – 189 с.