Разработка методики количественного определения флавоноидов
в траве Астрагала шерстистоцветкового Astragalus dasyanthus Pall

М.В. Лабковская¹, В.А., Куркин², А.А. Шмыгарева¹, А.Н. Саньков¹

¹Оренбургский государственный медицинский университет (г. Оренбург),
²Самарский государственный медицинский университет (г. Самара)

 

Development of a technique for quantitative determination
of flavonoids in the grass of astragalus woolly-flowered Astragalus dasyanthus Pall

M.V. Labkovskaya¹, V.A. Kurkin², A.A. Shmygareva¹, A.N. Sankov¹

¹Orenburg State Medical University (Orenburg, Russia),

²Samara State Medical University (Samara, Russia)

 

DOI: 10.54296/18186173_2022_4_22

 

РЕЗЮМЕ

Предложен новый метод количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид для сырья астрагала шерстистоцветкового (Astragalus dasyanthus Pall). Данный метод основан на использовании извлечения биологически активных веществ в режиме вакуумного кипения. При использовании данного метода максимальный выход суммы флавоноидов (в пересчете на гиперозид) составил 2,90 %. Предложенная нами методика проста в исполнении, требует минимальной затраты времени на анализ и обеспечивает максимально возможный выход действующих веществ.

Ключевые слова: астрагал шерстистоцветковый, Astragalus dasyanthus Pall., флавоноиды, гиперозид, стандартизация, спектрофотометрия.

 

RESUME

A new method of quantitative determination of the total flavonoids calculated on hyperoside for raw materials of astragalus woolly-flowered (Astragalus dasyanthus Pall) is proposed. This method is based on the use of extraction of biologically active substances in the vacuum boiling mode. When using this method, the maximum yield of the total flavonoids (calculated on hyperoside) was 2.90 %. The proposed method is simple in execution and requires minimal time for analysis and provides the maximum possible yield of active substances.

Keywords: Astragalus dasyanthus Pall., flavonoids, hyperoside, standardization, spectrophotometry.

 

Введение

Астрагал шерстистоцветковый (Astragalus dasyanthus Pall.) (рис. 1) семейство бобовые (Fabaceae) произрастает в лесостепных зонах России, Молдавии и Украины. Его можно встретить на равнинной поверхности, которая покрыта растительностью.

Рис. 1. Астрагал шерстистоцветковый (Astragalus dasyanthus Pall.)

 

Трава астрагала активно применяется в народной медицине при повышенном артериальном давлении, слабой сопротивляемости инфекциям и лихорадке [13]. В медицинской практике к использованию разрешен настой травы астрагала шерстистоцветкового. Особенно эффективно применение настоя травы астрагала шерстистоцветкового на начальных стадиях гипертонической болезни и при хронической сердечно-сосудистой недостаточности со склонностью к спазмам коронарных сосудов, а также острых и хронических нефритах. Настой травы астрагала шерстистоцветкового способствует расширению сосудов головного мозга и периферических сосудов, что значительно улучшает кровообращение, показатели общей и внутрисердечной гемодинамики, а также насыщает внутренние органы кислородом [4]. Данный спектр фармакотерапевтического действия обусловлен ведущими группами веществ: сапонинами и флавоноидами (среди которых доминирует гиперозид) [5]. Несмотря на широкое применение в народной и официальной медицине, проблема стандартизации астрагала шерстистоцветкового не решена. В ГФ РФ XIV издания фармакопейные статьи на сырье астрагала шерстистоцветкового не представлена [4]. Таким образом, разработка методов стандартизации является актуальной.

Процесс экстракции биологически активных веществ (БАВ) из лекарственного растительного сырья является одним из наиболее важных этапов при стандартизации лекарственных растений, и в дальнейшем изученные параметры могут быть использованы в качестве основы при разработке методик экстрагирования при изготовлении препаратов на их основе [8, 9]. От полноты экстракции во многом зависит фармакологический эффект препарата, и, соответственно, эффективность лечения [7, 10]. Существуют различные фармакопейные методики экстрагирования биологически активных веществ из лекарственного растительного сырья [1, 2], однако данные способы занимают немалое количество времени и зачастую могут приводить к разрушению действующих веществ за счет длительного нагревания, а также высоких температур [5, 6, 11].

На наш взгляд, целесообразна разработка методики стандартизации количественного содержания действующих веществ для лекарственного растительного сырья астрагала шерстистоцветкового, обеспечивающей минимизацию времени исследования и упрощение техники исполнения.

Предложенный нами метод экстрагирования в режиме вакуумного кипения позволяет решать вопросы оптимизации затраты времени на проведения анализа и повышения выхода действующих веществ.

Подвергаясь вакуумному кипению, сырье освобождается от газов, находящихся между частичками, в клетках и на поверхности, происходит удаление адсорбционных газов. Одновременно происходит дополнительное разрыхление волокон сырья за счет разрушения их структуры расширением объема газов и паров в фибриллярной структуре растительного сырья. Повышается удельная поверхность контакта сырья с экстрагентом и удаление газов из внутренних слоев и с поверхности материала, что благоприятствует более эффективной и быстрой экстракции. В результате вакуумирования происходит вскипание растворителя в порах сырья, а образующийся пар выталкивает насыщенный целевым компонентом экстрагент [3, 4, 12]. Таким образом, благодаря внутриклеточным физико­химическим процессам экстракция БАВ из сырья происходит за более короткий промежуток времени.

Цель исследования – разработать методику количественного определения флавоноидов в траве астрагала шерстистоцветкового (Astragalus dasyanthus Pall.) с максимально возможным выходом БАВ и с минимально затраченным временем на исследование.

 

Материалы и методы

Объектами исследования служили аптечные образцы травы астрагала шерстистоцветкового (Astragalus dasyanthus Pall.) производства ООО «Компания Хорст», Россия, г. Барнаул, 2021 год; образцы изготовлены по ГОСТ а также образцы астрагала, представленные в нутрицевтических магазинах ООО «Русские корни», Россия, Ростовская обл., 2020 год; ООО «Вита», Россия, г. Барнаул, 2021 год. Данные образцы изготовлены согласно ТУ. Электронные спектры измеряли на УФ-спектрофотометре UNICO 2800, ультразвуковая ванна Вилитек VBS, водяная баня «ЛАБ-ТБ-6/Ш», испаритель ротационный «ИР-1 ЛТ».

 

Результаты

Исследование УФ-спектров водно­спиртового извлечения из травы астрагала шерстистоцветкового показало, что максимум поглощения раствора водно­спиртового извлечения из травы астрагала шерстистоцветкового с 3 % раствором алюминия хлорида находится в области спектра при 399 ± 2 нм. В области электронного спектра гиперозида также наблюдается четкий максимум поглощения при 399 ± 2 нм. Следовательно, в качестве аналитической длины волны может быть использовано значение 399 нм, а стандартным образцом может служить доминирующий флавоноид – гиперозид, причем в случае отсутствия стандарта в расчетной формуле может быть использовано теоретическое значение удельного показателя поглощения (E ) – 330.

С целью обоснования методических подходов к стандартизации травы астрагала шерстистоцветкового проведено исследование по выделению групп веществ, содержащихся в астрагале. Экстракцию выполняли методами мацерации, а также мацерации с использованием ультразвуковой бани [11] и предложенным нами методом экстракции в режиме вакуумного кипения. В ходе исследования варьировалась концентрация экстрагента (спирта этилового), время экстракции, а также использовалась ультразвуковая баня и ротационный испаритель с целью увеличения выхода содержащихся веществ в сырье и ускорения экстракции и сокращения времени исследования (табл. 1).

 

Таблица 1

Влияние различных факторов на полноту извлечения
из травы астрагала шерстистоцветкового (Astragalus dasyanthus Pall.)

 

 

Спектрофотометрическое исследование водно­спиртовых образцов астрагала (рис. 2) показало, что предложенная нами методика (соотношение «сырье:экстрагент» 1:100, экстрагент 70 % спирт, время экстракции 10 минут в режиме вакуумного кипения при температуре 60 ºС) дает максимальный выход суммы флавоноидов (2,90 %), в пересчете на гиперозид, что составляет 81,3 ± 0,04 % по отношению к их содержанию в исходном сырье (рис. 2).

 

Рис. 2. Электронные спектры раствора водно-спиртового извлечения травы астрагала шерстицветкового с 3% раствором алюминия хлорида

Обозначения: А – мацерация 70% спиртом 40 мин. на водяной бане; Б – мацерация 70% спиртом 30 мин на водяной бане и 15 мин. УЗ; В – мацерация 40% спиртом 30 мин на водяной бане; Г – мацерация 96% спиртом 30 мин на водяной бане; Д – мацерация 70% спиртом 90 мин на водяной бане; Е – режим вакуумного кипения 70% спирт 10 минут.

 

Было проведено сравнительное определение суммы флавоноидов в экстрактах, полученных из астрагала разных производителей с использованием экстракции в режиме вакуумного кипения травы астрагала (табл. 2).

 

Таблица 2

Количественное содержание суммы флавоноидов
в траве астрагала шерстистоцветкового (Astragalus dasyanthus Pall.) разных производителей

 

№	Производитель	Условия экстракции	Содержание суммы флавоноидов, %
1	«Компания Хорст», Россия, г. Барнаул, 2021 год	1:10, экстрагент 70 % спирт, режим вакуумного кипения 10 мин, t= 60 ºС	2,90 ± 0,04
2	ООО «Русские корни», Россия, Ростовская обл., 2020 год	1:10, экстрагент 70 % спирт, режим вакуумного кипения 10 мин, t= 60 ºС	2,88 ± 0,04
3	ООО «Вита», Россия, г. Барнаул, 2021 год	1:10, экстрагент 70 % спирт, режим вакуумного кипения 10 мин, t= 60 ºС	2,90 ± 0,04

 

Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в режиме вакуумного кипения в сырье астрагала шерстистоцветкового представлены в табл. 3.

 

Таблица 3

Метрологические характеристики методики количественного определения
суммы флавоноидов в сырье астрагала шерстистоцветкового (Astragalus dasyanthus Pall.)

 

f		S	P, %	t (P,f)	DX	E, %
10	2,90	0,0599	95	2,25	±0,1336	±4,61

 

Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов составляет ±4,61.

Методика количественного определения суммы флавоноидов в водно­спиртовом извлечении травы астрагала шерстистоцветкового

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 100 мл, 70 % спирта этилового. Колбу закрывают пробкой, взвешивают с точностью до ± 0,01, помещают в ротационный испаритель (умеренное кипение) на 10 мин, при температуре 60 ºС. После чего взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр («красная» полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1,0 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 2,0 мл 3 % алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96 % спиртом этиловым. Измеряют оптическую плотность на спектрофотометре через 40 минут, при длине волны 399 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 1,0 мл извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора 96 % спиртом этиловым до метки. Содержание суммы флавоноидов проводят по формуле:

,

где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

m – масса сырья, г;

330 – удельный показатель превращения гиперозида при длине волны 399 нм;

W – потеря в массе при высушивании, в процентах.

 

Обсуждение и выводы

Разработана модификация спектрофотометрической методики количественного определения суммы флавоноидов в траве астрагала шерстистоцветкового c использованием экстракции в режиме вакуумного кипения. Содержание суммы флавоноидов в сырье варьирует от 2,88 ± 0,04 % до 2,90 ± 0,04 % (в пересчете на гиперозид). Данная методика позволяет получить максимально возможный выход флавоноидов с минимально затраченным временем исследования. Ошибка единичного определения суммы флавоноидов в траве астрагала шерстистоцветкового составляет ±4,61.

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Государственный реестр лекарственных средств. – Т.1. Официальное издание. М., 2008. – 1398 с. [Gosudarstvennyj reestr lekarstvennyh sredstv. – T.1. Oficial›noe izdanie. M., 2008. – 1398 s.]

2. P.A.G.M. de Smet, R. Hänsel, U. Sonnenborn, J. Westendorf, H. Winterhoff, H.J. Woerdenbag. Adverse Effects of Herbal Drugs 2 / I.H. Bowen, D. Corrigan, I.J. Cubbin [et al.]. – Springer Science & Business Media, 2012.

3. Государственная фармакопея Российской Федерации: Вып. 2. / МЗ РФ. 14-е изд. – М.: Медицина, 2018. – 3262 с. [Gosudarstvennaya farmakopeya Rossijskoj Federacii: Vyp. 2. / MZ RF. 14-e izd. – M.: Medicina, 2018. – 3262 s.]

4. Государственная фармакопея Российской Федерации: Вып. 4. / МЗ РФ. 14-е изд. – М.: Медицина, 2018. – 7019 с. [Gosudarstvennaya farmakopeya Rossijskoj Federacii: Vyp. 4. / MZ RF. 14-e izd. – M.: Medicina, 2018. – 7019 s.]

5. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов / В.А. Куркин. – Изд. 5-е, перераб. и доп. – Самара: ООО «Полиграфическое объединение «Стандарт»», ФГБОУ ВО «СамГМУ», 2020. – 1278 с. [Kurkin V.A. Farmakognoziya: Uchebnik dlya studentov farmacevticheskih vuzov / V.A. Kurkin. – Izd. 5-e, pererab. i dop. – Samara: OOO «Printing Association «Standard»», FGBOU VO «SamGMU», 2020. – 1278 s. (In Russ.)]

6. Куркин, В.А. Основы фитотерапии: Учебное пособие для студентов фармацевтических вузов / В.А. Куркин. – Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2009. – 963 с. [Kurkin V.A. Osnovy fitoterapii: Uchebnoe posobie dlya studentov farmacevticheskih vuzov / V.A. Kurkin. – Samara: OOO «Ofort», GOU VPO «SamGMU Roszdrava», 2009. – 963 s. (In Russ.)]

7. Ekor, M. The growing use of herbal medicines: issues relating to adverse reactions and challenges in monitoring safety [Text] / M. Ekor // Frontiers in Pharmacology. – 2014. – No. 4. – 539 р.

8. Промышленная технология лекарств: Учебник для студентов высших учебных заведений / В.И. Чуешов, М.Ю. Чернов, Л.М. Хохлова [и др.]. В 2-х т. – Т. 2 – Харьков: НФАУ МТК – Книга, 1999. – 704 с. [Promyshlennaya tekhnologiya lekarstv: Uchebnik dlya studentov vysshih uchebnyh zavedenij / V.I. Chueshov, M.Yu. Chernov, L.M. Hohlova [et al.]. V 2-h t. – T. 2. – Har’kov: NFAU MTK – Kniga, 1999. – 704 s. (In Russ.)]

9. Актуальные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов [Текст] / В.А. Куркин [и др.] // I Межвузовская студенческая научно­практическая конференция «Современные проблемы фармакогнозии». – Самара. – 2016. – С. 163–180. [Actual aspects of standardization of medicinal plant raw materials and medicinal herbal preparations [Text] / V.A. Kurkin [et al.] // I Interuniversity student scientific and practical conference «Modern problems of pharmacognosy». – Samara. – 2016. – pp. 163–180.]

10. Пономарев, В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья / В.Д. Пономарев. – М.: Медицина, 1976. – 204с. [Ponomarev, V.D. Ekstragirovanie lekarstvennogo syr’ya / V.D. Ponomarev. – M.: Medicina, 1976. – 204 s. (In Russ.)]

11. Акопян, В.Б. Основы взаимодействия ультразвука с биологическим объектами [Текст] / В.Б. Акопян, Ю.А. Ершов. – М.: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2005. – 203 с. [Akopyan, V.B. Fundamentals of ultrasound interaction with biological objects [Text] / V.B. Akopyan, Yu.A. Ershov. – M.: Bauman Moscow State Technical University, 2005. – 203 p. (In Russ.)]

12. Актуальные аспекты стандартизации видов лекарственного растительного сырья, включенных в государственную фармакопею российской федерации XIII издания [Текст] / В.А. Куркин [и др.] // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – 2016. – т. 18, №2(3). – С.730–736. [Actual aspects of standardization of medicinal plant raw materials included in the State Pharmacopoeia of the Russian Federation of the XIII edition [Text] / V.A. Kurkin [et al.] // Izvestiya Samara Scientific Center of the Russian Academy of Sciences. – 2016. – vol. 18, No. 2(3). – pp.730­736.]

13. Астрагал. При диабете, болезнях сердца, печени, нарушениях нервной системы URL: https://www.rulit.me/books/astragal-pri-diabete-boleznyah-serdca-pecheni-narusheniyah-nervnoj-sistemy-read-455089-1.html (дата обращения 01.08.2022).

 

 

Адрес автора

К. фарм. н. Лабковская М.В.

majya.rybalko@yandex.ru